We here identified for the first time the presence of Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) sheep (S) strain in Argentina. IS900 polymerase chain reaction (PCR) was positive. The S strain was compared with MAP cattle (C) strains by using IS1311 PCR-restriction endonuclease analysis (PCR-REA), multiplex PCR and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis.

Tuberculosis is one of the most important infectious diseases worldwide. Mycobacterium bovis is the causative agent of bovine tuberculosis (BTB), an important animal pathogen with public health implications as it is a zoonosis. Currently, the diagnosis of BTB is based on the caudal fold test of the Tuberculin Skin Test (TST). Post-mortem bacterial culture is carried out to confirm the diagnosis, and then specific biochemical tests are performed for the characterization of the etiologic agent. Culture takes at least 4 to 8 weeks to develop. The diagnosis by molecular tests such as PCR can provide fast and reliable results, significantly decreasing the time of confirmation (from two months to two days), thus allowing the possibility of taking control actions to prevent the spread of the disease in herds. In this work the use of an immunomagnetic separation capture followed by PCR (IMS-PCR) based on the IS6110 element showed a detection threshold corresponding to 10 CFU in M. bovis-spiked PBS. In the case of infected bovine fresh tissues, after five replicates, the minimum value of detection was 1000 CFU in 100% of the trials (5/5). This paper attempts to provide a sensitive, rapid and specific technique for the diagnosis of bovine tuberculosis, and opens up the possibility of a direct application in the control and eradication of this cattle disease.

La tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas más importantes. Mycobacterium bovis es el agente causal de la tuberculosis bovina (TBB), un patógeno animal y zoonótico. En la actualidad, el diagnóstico de TBB se basa en la prueba intradérmica de la tuberculina. El cultivo bacteriano post mortem se lleva a cabo para confirmar el diagnóstico y a continuación se realizan pruebas bioquímicas específicas para la caracterización del agente etiológico. El cultivo bacteriano toma por lo menos 4 a 8 semanas para su desarrollo. El diagnóstico mediante pruebas moleculares como PCR puede proporcionar resultados rápidos y robustos, con un considerable acortamiento hasta la confirmación del diagnóstico (de 2 meses a 2 días). En este trabajo, el uso de captura inmunomagnética seguida de PCR (IMS-PCR) dirigida al elemento IS6110 mostró un umbral de detección correspondiente a 10 UFC en M. bovis diluido en PBS. En el caso de tejidos bovinos inoculados experimentalmente después de 5 réplicas, el valor mínimo de detección fue de 1000 UFC en el 100% de los ensayos. Este artículo aspira a proporcionar una técnica sensible, rápida y específica para el diagnóstico de la tuberculosis bovina, con el fin de abrir la posibilidad de una aplicación directa en el control y la erradicación de esta enfermedad en el ganado.

Shiga toxin-negative Escherichia coli O157 strains of various H types have been associated with diarrhea in children and are considered potentially pathogenic for humans. In this study, we describe non-Shiga toxin-producing E. coli O157 E. coli strains previously obtained from dogs in Argentina. Different E. coli phylogenetic lineages corresponding to flagellar types H16, H29 and H45 were identified. E. coli serotypes O157:H16 and O157:H45 contained intimin subtypes e and a1, respectively. Serotype O157:H45 carried the bfp gene encoding the bundle-forming pilus. Localized adherence-like patterns to HEp-2 cells were observed in O157:H16 strains, while O157:H45 adhered in a typical localized pattern. A total of eight different XbaI-pulse field electrophoresis patterns with more than 74 % similarity were identified among the nine E. coli O157:H16 strains. Our data emphasized the fact that dogs may harbor human pathogenic E. coli O157 which do not correspond to Shiga toxin-producing strains and whose potential human health hazard should not be underestimated.

Cepas de E. coli O157 no productoras de toxina Shiga (Stx) que presentan diversos antígenos flagelares han sido aisladas de niños con diarrea y se consideran potencialmente patógenas para humanos. En el presente trabajo se describen cepas Stx-negativas de E. coli O157 de distintos tipos flagelares previamente aisladas de perros en Argentina. Los tipos flagelares H16, H29 y H45 correspondieron a diferentes grupos filogenéticos. Los serotipos O157:H16 y O157:H45 presentaron los subtipos de intimina e y a1, respectivamente. En el serotipo O157:H45 se detectó la presencia del gen bfp, codificante de la fimbria bundle-forming pili. El patrón de adherencia en células HEp-2 correspondió al tipo simil a localizada para E. coli O157:H16, mientras que O157:H45 mostró adherencia localizada típica. Dentro de las 9 cepas de E. coli O157:H16 estudiadas se detectaron 8 patrones de XbaI-PFGE con más del 74% de similitud. Nuestros datos confirman que los perros pueden ser portadores de E. coli O157 patógenas no productoras de Stx, las que representan un riesgo para la salud pública que no debe ser subestimado.

The bacillus Calmette-Guérin (BCG) was obtained in 1920 after successive passages leading to the attenuation of a Mycobacterium bovis strain. For the following 40 years, BCG had been replicated, resulting in substrains with genotypic and phenotypic differences. Several genomic studies have compared two BCG strains, M. bovis and Mycobacterium tuberculosis, and observed that deleted regions in the different strains could be related to differences in antigenic properties. In this work, a working seed lot was obtained from a lyophilized secondary seed lot from the BCG Pasteur strain 1173 P2 and genetically characterized. The genome was analyzed by PCR directed to five regions (RD1, RD2, RD14, RD15, DU2), using the seed lot and different available strains as templates. No genetic differences were found in the fragments studied as compared to the Pasteur strain. A total of 20 passages were carried out and no differences were found in the size of the fragments amplified by PCR. In conclusion, this method allows to control a working seed lot genotypically and to assess the stability of the BCG genome.

El bacilo de Calmette-Guérin (BCG) se obtuvo en 1920, después de sucesivos pasajes que llevaron a la atenuación de una cepa de Mycobacterium bovis. A lo largo de los 40 años subsiguientes la cepa BCG fue replicada y surgieron subcepas con diferencias fenotípicas y genotípicas. Se realizaron varios estudios de comparación genómica de diferentes cepas de BCG, M. bovis y Mycobacterium tuberculosis, y se observó que las deleciones de regiones en las diferentes cepas podrían estar relacionadas con diferencias en las propiedades antigénicas. En este trabajo se describe la preparación y caracterización genética de un lote semilla de trabajo obtenido a partir de un lote semilla secundaria liofilizado de la cepa BCG Pasteur 1173 P2. Se analizaron por PCR cinco regiones (RD1, RD2, RD14, RD15, DU2) en el lote semilla de trabajo utilizando como control las diferentes cepas disponibles. No se hallaron diferencias genéticas en los fragmentos estudiados al comparar el lote semilla de trabajo con la cepa BCG Pasteur 1173 P2. Asimismo, se efectuaron hasta 20 pasajes y no se encontraron diferencias en el tamaño de los fragmentos amplificados por PCR. En conclusión, se ha puesto a punto un método que permite controlar el genotipo de un lote semilla de trabajo y evaluar la estabilidad del genoma del BCG.

In the present work, 19 Mycobacterium bovis isolates from different cats were typified by spoligotyping. We detected nine spoligotypes. There was only one cluster, which grouped 11 of the isolates (57.9%), showing the main spoligotype from cattle from Argentina. The rest of the spoligotypes presented only one isolate each. Five of them were not found in cattle, and were unique and exclusive of cats. The isolates studied show that tuberculosis of bovine origin in cats constitutes a potential public health problem in Buenos Aires region. The identification of genotypes from non-natural hosts could contribute to understand the spread of bovine tuberculosis. This is the first report showing genetic profiles of M. bovis isolates in felines from Argentina.

En el presente trabajo se tipificaron por spoligotyping 19 aislamientos de M. bovis de diferentes gatos. Se detectaron 9 espoligotipos y un único agrupamiento o cluster integrado por 11 aislamientos (57,9%) y relacionado con el principal espoligotipo de bovinos de Argentina. El resto de los espoligotipos detectados presentaron solamente un aislamiento cada uno; 5 de ellos no se encontraron en bovinos y fueron únicos y exclusivos de gatos. La presencia de estos aislamientos indica que la tuberculosis bovina en los gatos constituye un potencial problema de salud pública en la ciudad de Buenos Aires. La identificación de genotipos de aislamientos de M. bovis de hospedadores no convencionales podría contribuir a la mejor comprensión de la diseminación de la tuberculosis bovina. Este es el primer informe en el que se muestran los perfiles genotípicos de aislamientos de M. bovis obtenidos de felinos de Argentina.

Avian tuberculosis is worldwide distributed and affects domestic and wild birds. Aetiological agent is Mycobacterium avium subsp. avium. Its zoonotic potential has acquired importance since HIV pandemia, that is why the manipulation of viable microorganism should be done with careful biosecurity measures. Primary source of infection is the environment contaminated with these microbes. Clinical signs are not uniform and the confirmation of the disease is by bacteriologycal isolation. The purpose was to identify by histopathologycal, bacteriologycal and molecular biology methods the aetiology from tuberculosis like lesions found in an ornamental race of Gallus sp. (Japanese Silkie) and Rhea americana. At post-mortem examination granulomas were observed which presented in the histopathology caseonecrotized center with acid-fast bacili. M. avium subsp. avium was confirmed by bacteriology and PCR in cultured strains. These allowed to arrive to the aetiologycal diagnosis by the combination of methods and describe for the fi rst time in Argentina tuberculosis in ratites.

La tuberculosis aviar tiene, distribución mundial y afecta a las aves domésticas y silvestres. El agente etiológico es Mycobacterium avium subsp. avium. El potencial zoonótico de esta enfermedad ha adquirido relevancia con la pandemia de HIV por ello todas las maniobras que involucren la manipulación de microorganismos viables, deben ser llevadas a cabo con adecuadas medidas de bioseguridad. La fuente primaria de infección es el ambiente contaminado con este agente. La presentación clínica es variable y el método definitivo para confirmar la infección es el aislamiento. El objetivo fue identificar mediante histopatología, bacteriología y biología molecular la etiología de lesiones compatibles con tuberculosis en una raza ornamental de Gallus sp. (sedosa del Japón) y Rhea americana (ñandú). En la necropsia se observaron granulomas que presentaron centro caseonecrótico no mineralizado con bacilos ácido-alcohol resistentes en la histopatología. Se confirmó la presencia de M. avium subsp. avium por bacteriología y por PCR en las cepas aisladas. Esto permitió arribar al diagnóstico etiológico combinando técnicas y describir por primera vez en la Argentina un caso de tuberculosis en ñandú.

The objective of the present work is to evaluate the repetition of the tuberculine skin test (TST) in cattle infected by Mycobacterium bovis and to determine the evolution of the size and consistency occurring in the caudal fold after the application of PPD. Fourteen naturally infected heifers were used to which the TST was repeated three times in folds in the caudal fold evaluating if the positive reaction remain as well as the physical characteristics of the caudal fold. 92,2% of the animals were positive in three repetitions and decrease in reaction size was observed, along with the successive repetitions. This endorses the national legislation that indicates not to repeat the test in positive animals.

El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la repetición de la prueba de intradermorreacción (IDR) en bovinos y comprobar la evolución en el tamaño y consistencia que se producen en el pliegue anocaudal en los días sucesivos a la aplicación del derivado proteico purificado (PPD). Se utilizaron 14 vaquillonas infectadas naturalmente con Mycobacterium bovis a las cuales se les repitió en tres oportunidades la IDR en el pliegue anocaudal analizando como se modificaban diariamente las características físicas del pliegue. El 92.2% de los animales fueron positivos en las tres repeticiones y se observó disminución en el tamaño de la reacción en las sucesivas repeticiones. Esto respalda la legislación nacional que indica no repetir la prueba en un animal positivo.

In 2003, the incidence of tuberculosis in Argentina showed an increase compared to 2002. The severe national crisis at the end of the 90s has probably strongly contributed to this situation. The goal of this work was to estimate the extent of the spread of the most predominant Mycobacterium tuberculosis strains and to assess the spread of predominant M. tuberculosis clusters as determined by spoligotyping and IS6110 RFLP. The study involved 590 pulmonary, smear-positive TB cases receiving medical attention at health centers and hospitals in Northern Buenos Aires (NBA) suburbs, from October 2001 to December 2002. From a total of 208 clinical isolates belonging to 6 major clusters, 63 (30.2%) isolates had identical spoligotyping and IS6110 RFLP pattern. Only 22.2% were shown to have epidemiological connections with another member of their respective cluster. In these major clusters, 30.2% of the 208 TB cases studied by both molecular techniques and contact tracing could be convincingly attributable to a recently acquired infection. This knowledge may be useful to assess the clonal distribution of predominant M. tuberculosis clusters in Argentina, which may make an impact on TB control strategies.

La incidencia de la tuberculosis en Argentina mostró en 2003 un incremento en comparación con 2002. La grave crisis nacional a fines de los 90 ha probablemente contribuido en gran medida a esta situación. El objetivo del presente trabajo fue determinar la diversidad genética de aislamientos de Mycobacterium tuberculosis y el grado de dispersión de algunas cepas mayoritarias genéticamente relacionadas. El estudio involucró 590 aislamientos clínicos provenientes de muestras respiratorias con examen directo positivo, de pacientes atendidos en los hospitales y centros de salud que conforman la región Gran Buenos Aires Norte (NBA), de octubre de 2001 a diciembre de 2002. De 208 aislamientos que se encontraron en los 6 mayores clusters, 63 (30,2%) tenían patrones idénticos de spoligotyping y de IS6110 RFLP. En el 22,2% de los casos fue posible verificar la conexión epidemiológica con otro miembro del respectivo cluster. Concluimos que el 30,2% de estos agrupamientos principales pueden ser atribuidos a una infección reciente. Estos resultados pueden ser útiles para determinar la distribución clonal de los grupos predominantes de M. tuberculosis en Argentina, lo que puede impactar en las estrategias de control de la tuberculosis.

During a population-based study to genotype isolates of Mycobacterium tuberculosis from Buenos Aires Northern suburbs, we found isolates with molecular patterns related to those of the Beijing genotype. Five out of 590 (0.85%) patients had isolates with spoligopattern identical to that of the Beijing family. Since two of these isolates showed identical IS6110RFLP pattern, we found only four different patterns containing 11 to 19 bands. The isolates were obtained from young people (including a 7 years-old child) who were born in Argentina, and were living in a small area of our region. However, conventional contact tracing did not prove epidemiological linkage among them. These isolates were fully drug-susceptible to the first-line drugs. The comparison of the IS6110RFLP patterns from our isolates against a set of 19 reference Beijing patterns from the RIVM (The Netherlands) confirmed that the strains belonged to the Beijing lineage. These findings might be partially explained by the important migration phenomena occurred during the last decade. Further surveillance studies would help in the following of Beijing family strain dissemination in our community.

Durante un estudio poblacional para genotipificar aislamientos de Mycobacterium tuberculosis de Gran Buenos Aires Norte, se encontraron aislamientos con patrones moleculares relacionados con el genotipo Beijing. Cinco de 590 (0,85%) pacientes tuvieron aislamientos con un patrón de spoligotyping idéntico al de la familia Beijing. Dos de esos aislamientos mostraron un patrón de IS6110 RFLP idéntico, por lo que finalmente fueron encontrados cuatro patrones diferentes conteniendo entre 11 y 19 bandas. Las cepas fueron aisladas de personas jóvenes incluyendo un niño de siete años de edad, todos ellos nacidos en Argentina y residentes en un pequeño distrito de nuestra región. Sin embargo, no pudo hallarse ninguna conexión epidemiológica entre ellos. La comparación de los patrones de IS6110 RFLP de los aislamientos con un panel de 19 cepas Beijing de referencia del RIVM (Holanda), confirmó que estas cepas pertenecían a ese linaje. Estos hallazgos podrían explicarse, parcialmente, por el importante fenómeno migratorio ocurrido la pasada década. Futuros estudios de vigilancia epidemiológica podrían contribuir en el seguimiento de la diseminación de las cepas de la familia Beijing de M. tuberculosis en nuestra comunidad.

A commercial kit intended for Taq polymerase inhibitor removal was tested to detect Shiga-toxigenic Escherichia coli (STEC) by polymersase chain reaction (PCR) directly from cattle fecal samples. Forty-five samples were analysed for the presence of stx genes. Results were compared to those obtained by two other methods: amplification of DNA purified by a non-commercial procedure (heat lysis protocol), and amplification of DNA from samples cultured in solid media, commonly used in our lab. Identical numbers of positive samples (33/45, 73 %) were obtained with the QIAamp DNA stool purification kit and the culturing procedure, suggesting an adequate removal of inhibitors that interfere in PCR amplification from the feces. Besides, the number of positive samples detected using DNA purified by the non-commercial protocol was lower, 25/39 (64%) than that achieved by using the kit. In conclusion, the use of the QIAamp DNA stool purification kit provided a rapid stx gene detection by PCR in bovine fecal samples.

Un kit comercial diseñado para la eliminación de inhibidores de la polimerasa Taq fue ensayado para la detección de STEC por PCR en muestras fecales de bovinos. Cuarenta y cinco muestras fueron evaluadas por la presencia de genes stx. Los resultados fueron comparados con aquéllos obtenidos por otros dos métodos: amplificación de ADN purificado por un procedimiento no comercial (protocolo de lisis por calor), y amplificación de ADN de muestras cultivadas en medio sólido, comúnmente usado en nuestro laboratorio. El mismo número de muestras positivas (33/45, 73 %), fueron obtenidas con el QIAamp DNA stool purification kit y el procedimiento de cultivo, sugiriendo una eliminación adecuada de inhibidores que interfieren con la amplificación en materia fecal. Por otro lado, el número de muestras positivas detectadas usando ADN purificado por el protocolo no comercial fue menor, 25/39 (64%). En conclusión, el uso del kit QIAamp DNA stool purification permitió una detección rápida de genes stx por PCR en muestras fecales bovinas.

Purification and characterization of individual antigenic proteins are essential for the understanding of the pathogenic mechanisms of mycobacteria and the immune response against them. In the present study, we used anion-exchange chromatography to fractionate cell extracts and culture supernatant proteins from Mycobacterium bovis to identify T-cell-stimulating antigens. These fractions were incubated with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from M. bovis-infected cattle in lymphoproliferation assays. This procedure does not denature proteins and permits the testing of mixtures of potential antigens that could be later identified. We characterized protein fractions with high stimulation indices from both culture supernatants and cell extracts. Proteins were identified by two-dimensional gel electrophoresis followed by N-terminal sequencing or MALDI-TOF. Culture supernatant fractions containing low molecular weight proteins such as ESAT6 and CFP10 and other proteins (85B, MPB70), and the novel antigens TPX and TRB-B were associated with a high stimulation index. These results reinforce the concept that some low molecular weight proteins such as ESAT6 and CFP10 play an important role in immune responses. Also, Rv3747 and L7/L12 were identified in high stimulation index cell extract fractions. These data show that protein fractions with high lymphoproliferative activity for bovine PBMC can be characterized and antigens which have been already described and new protein antigens can also be identified in these fractions.

Diagnosis of the Mycobacterium tuberculosis complex by direct PCR of mediastinal lymphnode DNA and microbiological tests were compared in cattle suspicious of bearing tuberculous-like lesions detected during slaughter. The PCR procedure applied on DNA samples (n=54) obtained by adding alpha -casein into the thiocyanate extraction mix was positive in 70% of the samples. PCR confirmed the identification of 23 samples (100%) that grew in culture, 9 samples (60%) that failed to grow in culture, plus 6 (37.5%) samples that resulted in growth of bacterial contaminants. Genotyping by IS6110-RFLP and DR-spoligotyping analysis of seven samples revealed the presence of several polimorphisms. Seven of the isolates contained multiple copies of IS6110, thus defining the existence of five singular genotypes.